Tillsammans med många av de kända ansiktena från första filmen och ännu fler nya bekantskaper, rusar vår käre museivakt genom natten för att ställa allt tillrätta. Den här gången utspelar sig handlingen på världens största museum, Smithsonian Institute. Möt romerska fältherrar med attityd, amerikanska presidenter med humor, dinosaurier som sliter sig, statyer som får liv, indianer som slåss för sitt land - När ljuset släcks börjar äventyret.